نکات مهم در انتخاب کیت HPV چیست؟

HPV  چیست؟

عفونت ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) توسط یک ویروس DNAدار از خانواده Papillomaviridae ایجاد می‌شود. ویروس‌های پاپیلوما ویروس‌های کوچک، بدون پوشش، اپیتلیوتروپیک و DNAدار دو رشته‌ای هستند که می‌توانند اپیتلیوم بافت‌های مخاطی و پوستی را در طیف گسترده‌ای از مهره‌داران عالی آلوده کنند و باعث القای تکثیر سلولی شوند. در این میان، ویروس‌های پاپیلومای گاوی ۱ و ۲ قادر به آلوده‌کردن بافت‌های مزانشیمی می‌باشند و به عنوان عامل انتقال پاپیلومای بین‌گونه‌ای شناخته شده‌اند.

ژنوتایپ‌های مختلفی از ویروس HPV وجود دارد که در خانواده‌های μ ،Ɣ ،β ،α و η طبقه‌بندی می‌شوند(۱). بیش از ۴۰ تایپ از HPVها مربوط به خانواده α می‌باشند که این خانواده می‌توانند بیماری‌های مقاربتی در بدن فرد آلوده ایجاد کنند که این گروه از ویروس‌ها اکثرا دارای تروپیسم خاص به لایه‌های مخاطی هستند(۲).

در یک طبقه‌بندی دیگر HPV ها در دو گروه High Risk و Low Risk قرار می‌گیرند که HPVهای پرخطر (HR HPVs) عامل ایجاد بیش از ۸۰ درصد نئوپلازی‌های داخل اپیتلیال گردن رحم با درجه بالا هستند.

اهمیت تشخیص تایپ‌های کم خطر در در کیت‌های ژنوتایپینگ HPV

HPVهای کم‌خطر(LR HPVs)  مسئول کندیلوم‌هایی هستند که در ۱ تا ۲ درصد از جمعیت فعال جنسی یافت می‌شوند. اصطلاح به ظاهر “کم‌خطر” که برای توصیف این گروه استفاده می‌شود، تصوری اشتباه در ارتباط با پاتوژنسیتی این گروه ایجاد می‌کند؛ چرا که این گروه کم‌خطر نیز می‌تواند عوارضی در بدن فرد مبتلا ایجاد کند که هم از نظر روانشناختی و هم از نظر کلینیکال حائز اهمیت می‌باشد، نظیر پاپیلوم‌های مزمن حنجره، که گاها در کودکان و بزرگسالان رخ می‌دهد، در این عارضه لازم است تخلیه منظم با جراحی انجام شود تا امکان تنفس برای فرد مبتلا حفظ شود. چنین عفونت‌هایی قابل درمان نیستند و در ۱ تا ۳ درصد موارد، در صورت عدم پیگیری، با خطر پیشرفت به سمت سرطانی شدن همراه است.

به طور مشابه، انواع β HPV نیز که شیوع بالایی در سرتاسر جهان دارند می‌توانند باعث عفونت‌های بدون علامت در محل‌های پوستی شوند و گاهی اوقات می‌توانند باعث ایجاد پاپیلوماتوز ناتوان‌کننده با خطر سرطان مرتبط شوند. برخی از انواع این ژنوتایپ‌های HPV قادر به ایجاد ضایعات علامت‌دار هیپرپرولیفراتیو هستند که این ضایعات بر اساس بنیه ژنتیکی فرد میزبان با بیماری‌زایی و تروپیسم خاص بروز پیدا می‌کنند(۲-۵).

در اکثر مقالات به این موضوع اشاره شده است که عفونت با گروه کم‌خطر توسط سیستم ایمنی میزبان حذف می‌شود اما واقعیت این است که حذف ویروس در بدن، کاملا وابسته به قدرت سیستم ایمنی میزبان است در نتیجه برخی از افراد قادر به حذف کردن چنین ضایعاتی بر اساس پروسه طبیعی بدن نیستند و اگر این عفونت‌ها کنترل نشده باقی بمانند می‌توانند مشکلات بالینی جدی نظیر Recurrent Respiratory Papillomatosis)RRP، EV(Epidermodysplasia Verruciformis)) و … ایجاد کنند. از طرف دیگر عدم شناسایی این ژنوتایپ‌ها می‌تواند باعث افزایش شیوع آن‌ها در بین افراد جامعه شود(۶-۹). در نتیجه همان‌طور که اشاره شد با توجه به قدرت متفاوت سیستم ایمنی در بدن افراد مختلف شناسایی تایپ‌های کم‌خطر نیز حائز اهمیت است و نباید نادیده گرفته شود.

با توجه به موارد ذکر شده لازم است در انتخاب کیت‌های تشخیصی بسیار حساسیت به خرج داد و کیتی مورد استفاده قرار گیرد که علاوه بر اینکه قادر باشد تایپ‌های حساس در بالین را شناسایی کند، از حساسیت کافی برای تشخیص غلظت‌های پایین ویروس نیز برخوردار باشد تا احتمال شیوع بیشتر این ویروس بین افراد جامعه به حداقل سطح ممکن برسد.

وجود روشی که بتواند جوامع جهانی را به درستی و دقت بالا از وجود HPV  و شناسایی ژنوتایپ آن آگاه کند، بسیار ضروری است بدین منظور لازم است آزمایشگاه‌ها با تکنیک‌های مختلف و معایب و مزایای هر تکنیک آشنا باشند.

انتخاب بهترین تکنیک در تشخیص HPV

تکنیک‌های رایج مورد استفاده برای ژنوتایپینگ HPV، شامل تکنیک Hybrid، Microarray، Real Time PCR و Sequencing می‌باشد. روش توالی‌یابی، به عنوان روش Gold Standard در تشخیص HPV در نظر گرفته می‌شود که نسبت به سایر تکنیک‌ها دقیق‌ترین نتایج را ارائه می‌دهد اما یکی از معایب این روش عدم وجود تجهیزات و تخصص لازم در اکثر آزمایشگاه‌های مولکولی می باشد.

تکنیک‌های هیبریداسیون و میکروآرایه قادر به تشخیص تعداد زیادی از تایپ‌های ویروس HPV در یک واکنش می‌باشند اما توانایی این تکنیک‌ها در جداسازی تایپ‌هایی که در درخت فیلوژنیک نزدیک به هم قرار دارند بسیار کم است. این تایپ‌های نزدیک به هم دارای توالی‌های مشابه به هم هستند که به این توالی‌ها، توالی‌های homonymous می‌گویند و از آن‌جایی که کیت‌های تشخیصی مبتنی بر تکنیک هیبرید (دستی و اتومات) توان جداسازی تایپ‌هایی که کمتر از  ۱۵% باهم اختلاف توالی داشته باشند را ندارند، در نتیجه نرخ نتایج مثبت کاذب در این تکنیک بیشترخواهد بود، بدین صورت که توالی‌های به‌دست‌آمده طی مرحله‌ی اول تکثیر (PCR) ، در مرحله‌ی هیبرید ممکن است به صورت کاذب به  پروب‌ مربوط به تایپ‌هایی که در درخت فیلوژنیک با هم در یک گروه قرار می‌گیرند متصل شوند و نتایج کاذب بدین صورت ایجاد گردد(۱۰).

در مطالعه‌ای که توسط Nicolas و همکارانش در فرانسه انجام شده است، تعداد زیادی از نمونه‌ها با دو روش تعیین توالی و هیبریداسیون مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که دقیقا مطابق آنچه گفته شد نتایج مثبت کاذب در تکنیک هیبریداسیون، به دلیل وجود برخی از تایپ‌ها که با هم قرابت توالی دارند بسیار زیاد است که نمونه‌ای از این نتایج در جدول(۱) قرار داده شده است. به عنوان مثال در همین مطالعه نشان داده شده است اگر فردی از نظر آلودگی با ژنوتایپ ۵۳ مثبت باشد به احتمال ۵/%۳۸ می‌تواند تایپ ۶۶ و به احتمال۶/۳۵% می‌تواند تایپ ۵۶ مثبت نشان داده شود و یا اگر فرد تایپ ۵۶ مثبت داشته باشد به احتمال ۴۶% تایپ ۶۶ هم مثبت می‌شود یا اگر فرد، آلوده به تایپ ۶۶ باشد تایپ‌های ۵۳، ۵۶ و ۸۲ هم می‌تواند مثبت نشان داده شوند و در برخی موارد اگر فرد، آلوده به تایپ ۱۶ باشد احتمال مثبت شدن تایپ‌های ۴۵ و ۵۹ هم وجود دارد که علت تمام این نتایج کاذب استفاده از توالی‌های homonymous در طراحی کیت‌های مبتنی بر هیبریداسیون می‌باشد(۱۰).

جدول۱: مقایسه نتایج ژنوتایپینگ HPV با دو روش هیبریداسیون و توالی‌یابی

تکنیک دیگری که در تشخیص HPV به کار گرفته می‌شود، تکنیک Real Time PCR می‌باشد. در تکنیک Real Time PCR از آن‌جایی که علاوه بر پرایمرهای اختصاصی، پروب هم به صورت اختصاصی برای ژنوتایپ مشخصی طراحی می‌شود و تا زمانی که تمام عوامل(پرایمر و پروب) به درستی به توالی مورد نظر وصل نشده باشند، هیچ نوری ساطع نخواهد شد، پس اختصاصیت این تکنیک نسبت به تکنیک هیبریداسیون بسیار بیشتر خواهد بود. در تکنیک هیبریداسیون در مرحله‌ی اول، تکثیر با پرایمر‌های یونیورسال انجام خواهد شد و در مرحله‌ی بعد، اتصال به پروب‌های حک شده بر استریپ‌های تشخیص، انجام خواهد گرفت. در حالیکه در تکنیک Real Time باید هم پرایمر و هم پروب، همزمان به جایگاه صحیح مکمل خود متصل شده باشند و در صورت اتصالِ فقط پرایمر در جای صحیح یا اتصال صحیح پروب به تنهایی هیچ نوری نمی‌تواند ساطع شده و هیچ پیکی مشاهده نمی‌گردد پس به مراتب نتایج کاذب کمتری ایجاد خواهد شد.

علاوه بر لزوم انتخاب تکنیک مناسب جهت تشخیص HPV، توجه به توالی‌های تشخیصی طراحی‌شده در کیت نیز از اهمیت خاصی برخوردار است. توالی‌های طراحی شده می‌بایست بر اساس آخرین تغییرات درخت فیلوژنیک HPV باشند. در اکثر کیت‌های رایج در بازار، طراحی بر اساس داده‌های فیلوژنیک قدیمی می‌باشد، به عنوان مثال در مطالعات پیشین، تایپ‌های ۵۴ و ۵۵ هر دو به عنوان یک تایپ و به نام تایپ ۵۴ در نظر گرفته ‌شده که موجب نتیجه کاذب در کیت‌های مربوطه می‌گردید، اما در برخی کیت‌های جدید این دو تایپ از هم تفکیک شده و توالی طراحی شده تنها مربوط به تایپ ۵۴ می‌باشد و وجود تایپ ۵۵، نتیجه کاذب ایجاد نخواهد کرد. این نکته مخصوصا در طراحی کیت‌هایی که دارای تاییدیه سازمان بهداشت جهانی می‌باشند بسیار حائز اهمیت است زیرا یکی از الزامات اخذ تاییدیه سازمان بهداشت جهانی طراحی کیت بر اساس آخرین اطلاعات درخت فیلوژنیک می باشد(۱۰).

نکات مهم در انتخاب کیت  HPV

لذا با توجه به تمامی موارد ذکر شده به این نتیجه می‌رسیم که در انتخاب کیت باید چند نکته مهم را مد نظر قرار داد:

1. در موارد تشخیصی از کیت‌هایی استفاده شود که قادر به شناسایی تایپ‌های به اصطلاح کم‌خطر نیز باشند تا از شیوع بیشتر این تایپ‌ها در جامعه جلوگیری شود و از به خطر افتادن زندگی افرادی که سیستم ایمنی بدن آن‌ها قادر به حذف کامل این ویروس‌ها از بدن نیست جلوگیری شود و عوارض روانشناختی ناشی از آلودگی با این تایپ‌ها هم در افراد ایجاد نشود.
2. کیت انتخابی باید دارای اختصاصیت بالایی در تفکیک تایپ‌ها از هم باشد تا نتایج کاذب موجب خطا در تشخیص و درمان و ایجاد استرس مضاعف در بیمار نگردد.
3. در زمان انتخاب کیت، در ارتباط با طراحی کیت و توالی‌های تشخیصی تحقیق شود که توالی‌ها بر اساس آخرین داده‌های موجود در پایگاه‌های توالی‌یابی و جدیدترین درخت‌های فیلوژنیک باشد تا داده‌های قدیمی موجب خطا در نتایج نشوند.

References:

1. De Villiers EM (2013) Cross-roads in the classification of papillomaviruses.  Virology 445: 2–۱۰.
2. Egawa N, Doorbar J. The low-risk papillomaviruses. Virus research. 2017 Mar 2;231:119-27.
3. Carifi, M., Napolitano, D., Morandi, M., Dall’Olio, D., 2015. Recurrent respiratorypapillomatosis: current and future perspectives. Ther. Clin. Risk Manag. 11,731–۷۳۸.
4. Woodhall, S.C., Jit, M., Soldan, K., Kinghorn, G., Gilson, R., Nathan, M., Ross, J.D.,Lacey, C.J., group, Q.s., 2011. The impact of genital warts: loss of quality of lifeand cost of treatment in eight sexual health clinics in the UK. Sex. Transm.Infect. 87 (6), 458–۴۶۳.
5.  Mortensen GL. Long-term quality of life effects of genital wartsda follow-study. Dan Med Bull 2010;57:A4140.
6.  Muñoz N, Bosch FX, de Sanjosé S, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med. 2003;348:518–۵۲۷.
7. Lacey CJN. Therapy for genital human papillomavirus-related disease. J Clin Virol. 2005;32(suppl):S82–S90. [PubMed] [Google Scholar] [Ref list]
8.  Kodner CM, Nasraty S. Management of genital warts. Am Fam Physician. 2004;70:2335–۲۳۴۲.
9.  La Vecchia C, Franceschi S, Decarli A, et al. Sexual factors, venereal diseases, and the risk of intraepithelial and invasive cervical neoplasia. Cancer. 1986;58:935–۹۴۱