آزما تامین دانش گستر

اگر حجم نهایی واکنش یک کیت از حداکثر حجم قابل تشخیص دستگاه PCR/Real Time PCR  کمتر باشد چه باید کرد؟

درهنگام استفاده از برخی از کیت‌ها، حجم کل واکنش بیشتر از حجم نهایی قابل خوانش توسط دستگاه Real Time PCR/PCR می‌باشد مثلا حجم نهایی واکنش کیت HBV به ۶۰ لاندا می‌رسد در حالیکه در استریپ‌های دستگاه، فقط باید ۳۰ لاندا محلول واکنش وجود داشته باشد، در چنین مواردی بایستی ابتدا حجم نهایی واکنش در یک میکروتیوب استریل تهیه گردد و همه‌ی مواد کاملا با هم مخلوط شوند؛ به این منظور از یک ورتکس خیلی کوتاه و چند بار پیپتاژ استفاده می‌شود تا یک محلول همگن به دست آید از این محلول مقدار ۳۰ لاندا برداشته شده و به استریپ دستگاه انتقال داده می‌شود. در این صورت غلظت واکنش‌گرها نظیر پرایمر، پروب، آنزیم و… ثابت خواهد بود و در حالت بهینه شده‌ی واکنش است و آن چه تغییر می‌کند فقط حجم واکنش می باشد لذا اختلالی در انجام واکنش نخواهیم داشت.

چرا با کیت A، کنترل منفی‌ها مثبت کاذب می‌شوند اما با کیت B، مثبت کاذب مشاهده نمی‌شود؟

به منظور پاسخ به این سوال بهتر است ابتدا با انواع آلودگی در بخش مولکولی آشنا شویم.

عمومی‌ترین منشاءهای آلودگی‌ به شرح ذیل است:

۱-الگوی DNA اصلی (نمونه استخراج شده)

۲-مولکول‌های کلون شده که ژن هدف را حمل می‌کنند (مثل کنترل مثبت که پلاسمیدهای حاوی ژن هدف است)

۳-امپلیکون‌ها (مولکول‌های تکثیر شده از PCR قبلی)

۴- سایر منابع آلودگی: گاهی ممکن است نمونه‌های مورد بررسی با DNA انسانی آلوده شوند به این صورت که یک قطعه میکروسکوپی از پوست یا حتی شوره می‌تواند عامل آلوده کردن PCR باشد و به صورت بالقوه منجر به نتیجه نادرست گردد.

جواب سوال:

در نتیجه جواب مثبت کاذب کنترل منفی می‌تواند وجود امپیلیکون‌های تکثیر شده با کیت A در محیط کار باشد که اگر کیت B پرایمرهایش قابلیت شناسایی این توالی را نداشته باشند با کیت B نتایج مثبت کاذب حذف می‌شود. در چنین شرایطی بهتر است برای مدت کوتاهی از کیت تشخیصی استفاده کنید که توالی‌های هدف آن متفاوت از کیت قبلی باشد.

چگونگی تفسیر پیک‌های کنترل مثبت

Positive Control حاوی الگویی با قدرت تکثیر بالا می‌باشد که شامل ناحیه تکثیر شونده توسط پرایمرهای ژن هدف است.

هدف کنترل مثبت بررسی عملکردی بودن و اطمینان از صحت اضافه شدن تمامی واکنشگرها می‌باشد.

اگر P.C وارد مرحله استخراج شود، صحت کار استخراج و تکثیر بررسی می‌شود ولی اگر وارد مرحله استخراج نشود، فقط صحت مرحله تکثیر بررسی می‌شود.

در هر سری کاری استفاده از یک کنترل مثبت الزامی می‌باشد اما بهتر است که نمونه کنترل مثبت به عنوان آخرین نمونه به ویال‌های واکنش اضافه شود. زیرا اضافه کردن این نمونه در اول کار می‌تواند عامل انتقال آلودگی به سایر ویال‌ها باشد.

اگر کنترل مثبت پیک ندهد و یا پیک با CT بالا داشته  باشد نمی‌توان به جواب‌های منفی مطمئن بود. چون همانطور که گفته شد کنترل مثبت قدرت تکثیر بالا دارد و عدم وجود پیک مناسب در این نمونه می‌تواند دال بر ضعف در مراحل تکثیر باشد. پس پیشنهاد می‌شود نمونه‌های منفی این سری کاری مجدد در یک سری کاری جدید مورد بررسی قرار گیرد.

چگونگی استفاده از پیک Internal Control در تفسیر نتایج Real Time

اینترنال کنترل (IC):

هدف استفاده از IC پیگیری صحت و کیفیت پروسه نمونه‌گیری، استخراج و تکثیر می‌باشد.  معمولا ژن‌های house keeping که در همه‌ی سلول‌ها بیان می‌شوند به عنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار می‌گیرند نظیر ژن بتاگلوبین، GAPDH و …

اینترنال کنترل به دو صورت اندوژن و اگزوژن وجود دارد.

از طریق بررسی اینترنال کنترل اندوژن علاوه بر مرحله استخراج و تکثیر، کیفیت نمونه‌گیری هم کنترل می‌شود اما اینترنال کنترل اگزوژن فقط مرحله‌ی استخراج و تکثیر را کنترل می‌کند.

تفسیر پیک‌های اینترنال کنترل:

• اگر ژن‌های هدف پیک سیگموئیدی با CT قابل قبول داشتند اما اینترنال کنترل پیک خوبی نداشت بدان معنی است که تکثیر اینترنال کنترل در رقابت با ژن‌های اصلی جامانده است، در این حالت نتیجه مثبت قابل گزارش می‌باشد.
• اگر ژن‌های هدف هیچ پیکی نداشت و اینترنال هم پیک با CT بالا گرفته بود یا اصلا پیک نداشت بدان معنی است که در فرآیند تکثیر (از نمونه‌گیری تا تکثیر) اختلالی وجود داشته و نتیجه قابل گزارش نیست.
• کیت‌هایی که هم اینترنال کنترل اندوژن و هم اینترنال کنترل اگزوژن دارند می توانند پایش بهتری در مورد کیفیت مراحل مختلف کار ارائه دهند؛ مثلا اگر پیک IC اندوژن بالا نیاید اما پیک IC اگزوژن بالا بیاید نشان دهنده‌ی خطای نمونه‌گیری است.

چگونه برای یک نمونه wart، تست HPV انجام شود؟

نکات نمونه‌گیری از wart:

• برای برداشت نمونه، زگیل‌های گل‌کلمی و زگیل‌های flat تیره در اولویت نمونه‌گیری هستند.
• برداشت نمونه wart باید با استفاده از تیغ‌های یکبار مصرف استریل انجام شود.
• قبل از انجام نمونه‌گیری باید مطمئن شد که شرح حال کاملی از مراجعه‌کننده گرفته شده است؛ زیرا ممکن است الزام به نمونه‌گیری از دهان، حلق و مقعد نیز وجود داشته باشد.

نکات انتقال نمونه:

• نمونه گرفته شده از بانوان در محیط مخصوص پاپ اسمیر قرار داده شود.
• نمونه آقایان بایستی در محلول PBS گذاشته شود.
• دقت شود که محیط‌های انتقال فاقد فرمالین باشد.

نکات استخراج:

• برای استخراج از wart بایستی از کیت‌های مخصوص استخراج از بافت نظیر کیت Genomic Extraction استفاده کرد.
• نمونه به دست آمده از wart بایستی به دو قطعه تقسیم شود؛ یک قطعه آن استخراج گردد و قطعه دیگر در میکروتیوب استریل در دمای °۲۰ سانتی گراد به عنوان نمونه استوک نگهداری گردد.

هنگام انجام تست HPV، احتمال آلودگی در تکنیک Hybrid کمتر است یا Real Time PCR؟

از آنجایی که در تکنیک Hybrid برای مشاهده نتیجه کار، محصول تکثیر شده در مرحله PCR باید به روی استریپ‌ انتقال داده شود، باز کردن درب میکروتیوبِ حاوی قطعات تکثیر شده‌ی ویروس، احتمال آلوده کردن محیط را افزایش می‌دهد.
اما در تکنیک Real Time PCR، محصول تکثیر شده Out ‌می‌شود و نیازی به باز شدن درب میکروتیوب نیست. یعنی در واقع تکنیک Real Time مرحله Post PCR ندارد.
پس آلودگی در تکنیک Real Time PCR به مراتب کمتر از تکنیک Hybrid است.